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實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）是一種高靈敏度、高精確度的分子生物學(xué)技術(shù)，用于檢測和量化DNA或RNA的數(shù)量。該項技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物相關(guān)行業(yè)的檢測項目中，其中就包括支原體檢測。
我們都知道，支原體污染對于細(xì)胞相關(guān)的臨床項目危害巨大，支原體檢測是項目申報的必要環(huán)節(jié)。實現(xiàn)檢測的高靈敏度、高特異性，并盡可能縮短實驗時間，是非常有意義的。
藥典方法中，培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法都各有缺點，而qPCR方法兼顧了二者的優(yōu)點，受到眾多從業(yè)人員的青睞。那么在實驗過程中，有哪些注意事項？本期內(nèi)容，以德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor Gem qEP為例，盤點qPCR檢測支原體的關(guān)鍵點。
Venor Gem qEP試劑盒能檢測多種支原體、靈敏度高、遵循歐洲藥典流程要求。
Part.01 樣品處理
一般來說，該試劑盒適用于細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清等物質(zhì)的支原體檢測。
當(dāng)細(xì)胞長至80%-90%時，收集樣品。此時可對樣品進(jìn)行95℃的孵育處理。
需要注意的是：細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中可能存在PCR抑制物質(zhì)，例如：細(xì)胞顆粒、較大的樣品體積或其他生物材料（疫苗、石蠟包埋樣品等）、胎牛血清含量＞5%等情況，需要在進(jìn)行PCR之前，對樣品進(jìn)行DNA提取處理，以盡可能減輕無關(guān)因素對實驗結(jié)果的干擾。
這里推薦試用配套的德國MB支原體提取試劑盒：
有小伙伴可能會產(chǎn)生疑問：培養(yǎng)基中的青霉素或者鏈霉素，會不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響？
就目前有記錄的研究結(jié)果而言，沒有發(fā)現(xiàn)常用的“雙抗"會對檢測的靈敏度等造成影響。
Part.02 反應(yīng)體系建立
在進(jìn)行支原體qPCR檢測時，需要設(shè)置合適的反應(yīng)體系和條件。反應(yīng)體系包括Mix、樣品DNA、緩沖液、內(nèi)控等組分。反應(yīng)條件包括擴(kuò)增溫度、時間、周期數(shù)和熒光信號閾值等參數(shù)。
需要注意的是：需嚴(yán)格按照使用說明中的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。隨意更改數(shù)值可能會影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
Part.03 結(jié)果解釋
FAM通道：檢測支原體熒光信號。
HEX通道：檢測內(nèi)控對照熒光信號。
需要注意的是：支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號越高，檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。
定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。
Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。
當(dāng)前位置：
